测序样品送样要求和质量标准
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中兴博迈拒绝接收《人间传染的病原微生物名录》中危害程度为第一、第二类的高 致病组织、血液、细菌等样品，只接收提取得到的核酸样品。危害程度为第三、第 四类的致病性或传染性的组织、血液、细菌等样品，必须事先通过销售、客服或运 营经理与中兴博迈技术人员联系，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
样品寄送时应采用WHO提出的三级包装系统，第一层容器:装样品，要求防渗 漏；第二层要求耐受性好、防渗漏，容纳并保护第一层容器；第三层容器:放在一个 运输用外层包装内。在第二层包装注明“致病性样品，接收时请注意”字样，并在样 品信息单上注明其危害程度及接收注意事项。此类样品寄送时销售或运营经理务必 邮件通知样品组，告知样品组相关寄送信息(快递单号、样品类型、样品数量)以及 接收时的防护措施和注意事项。
一、DNA送样及质量判定标准
1）DNA样本避免反复冻融，避免紫外线、荧光染料等可能损伤DNA的环境或物质， 请尽可能提供新制备的DNA，低温运输；
2）DNA溶解在TEbuffer或EBbuffer中； 3)样品要求无色、透明、不粘稠、无不溶性杂质；
3）凝胶电泳结果:主条带明显无明显降解现象，-，胶孔无蛋白，无RNA残留，无明 显杂带；
4）脉冲场电泳条带：主带在30kb以上合格；
5）DNA总量要求:三代测序 单次建库起始DNA总量≥10μg/文库，浓度>80ng/μL(Qubit)；二代测序DNA总量≥3μg/文库，浓度>70ng/μL(Qubit)
6）样品纯度：OD260/280范围在1.7-2.0，OD260/230范围在1.8-2.2；
7）NC：QC<1.5 (NC：Nano浓度，QC:Qubit浓度)；
基础测序平台简介
不同组织样本提取得率估算表
二、RNA收样及质量判定标准
1) 样品类型：完整的、DNase处理过后的Total RNA，RNA提取的过程中避免蛋白污染；
2) 样品总量 ≥ 5µg；浓度 ≥300 ng/µL；二代建库≥ 3µg浓度 ≥70 ng/µL；
3) 样品纯度：OD260/280范围在2.0-2.2，OD260/230范围在1.8-2.1； RIN值植物>8、动物>9， 无28S物种，基线平整；
4) 无颜色、无不溶性杂质、无DNA污染。
1.RNA样品
1) RIN值偏低：样品降解；
注：RIN值是RNA完整性的一个指标，RIN值偏低，表示RNA有降解，会影响全长 转录本的获得，降低有效数据所占的比例，造成数据浪费。RIN值大于7.5，可风险 建库；
2) OD260/230不合格：OD260/230是衡量样品是否含有杂质的指标，OD值不合格，表示样品可能含有 杂质，杂质会影响反转录酶的活性及磁珠纯化回收率，造成建库失败。
处理建议：纯化，但纯化可能会造成样品降解，并且纯化损失率在30%－50%。浓度不足 Pacbio官方Protocol中第一步反转录要求totalRNA的起始量为1ug，3ul，即浓度需要在300ng/ul，浓度偏低会影响反转录效率，造成反转录失败；浓缩，样品浓缩过程中可能会造成样品降解，RIN值降低；另外， 总量小于3ug的样品不建议浓缩。
2. DNA样品
1) 样本降解
DNA片段在20Kb以下，打断造成文库插入片段偏短，造成数据Insert偏短。 建议：根据样品实际情况确定风险建库或重新送样。
2) 总量不足
建库最低起始量为10ug，由于DNA建库过程不进行PCR，总量不足容易造成纯 化后出库库容偏低，影响文库产出。
处理建议：补送样品。
3.主要杂质污染
蛋白、糖类等杂质会影响接头连接效率，没有加上接头的DNA，会在酶切纯化 阶段损失掉，造成建库失败。
处理建议：纯化，纯化可能会造成样品降解，并且纯化损失率在30%－50%。
四、DNA组织样本送样标准
1、总量标准需求
PCR产物送样标准：
（1）未纯化产物：样品目的条带清晰，无杂带，体积小于50μL，总量应大于1μg； 体积大于50μL,总量应大于2μg；
（2）纯化产物：若切胶纯化，琼脂糖凝胶的染料不能是溴化乙锭EB，样品目的条 带清晰，无杂带，纯化后体积小于50μL,总量应大于300ng。
注:1.组织样品，尽量送新鲜采集的样品，液氮速冻，干冰运输。 2.不同类型的样品DNA的产量差别较大，需要根据实际情况决定。像人或哺乳动物的全血中红细胞没有细胞核，每毫升血液中实用细胞数少，DNA得率比较低，送 样量需相应增加，而鸟类或鱼类血液中红细胞含有细胞核，DNA得率会增高，送样 量可适当减少。含肌纤维细胞丰富的肌肉组织以及含多糖多酚较高的复杂植物， DNA得率会受到影响；代谢活跃的肝脏组织由于细胞含量旺盛，每50mg组织可达到 20-30ug的核酸产量。
2、DNA组织样品采集指南
1）植物组织
大田或野外获取的材料，取材后需用70%酒精将材料表面的灰尘及泥土冲洗干 净，吸干，液氮速冻后，放入预冷的50mL离心管或是封口袋中，用大体积干冰运输， 且要保证中兴博迈在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
2）动物组织
活体取材后的组织需用0.9%生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组 织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，吸干，并将样品分割成50mg左右的小块(组 织越小，保存效果越好)，放入1.5mL或者2.0mL的EP管中，液氮速冻后用封口膜封 口，再将EP管放置于50mL离心管中或封口袋中，用大体积干冰运输，且要保证样 品组在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
3）血液要求为全血样本，并加入抗凝剂，推荐使用EDTA抗凝的采血管收集样品(由 于会影响实验，不能使用肝素抗凝)，冷冻后，干冰运输送样。
4)）离体培养细胞 a）贴壁细胞或悬浮细胞培养结束后，去除培养液；b）用PBS缓冲液 快速洗一次，除去PBS缓冲液，贴壁细胞可用细胞刮将其刮下；c）收集的细胞转入 1.5mL的EP管中用液氮速冻后，干冰运输。
1）对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根 据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。2)用于DNA样品制备实验的 组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品DNA降解。
2）在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进 行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。
五、RNA组织样本送样标准
1、总量标准需求:
2、RNA组织样品采集指南
液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下:
(1) 组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的50mL离心管或15mL离心 管，管盖须钻孔(防止管子内液氮体积膨胀爆炸)，并在离心管内加满液氮；
(2) 组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的离心管中彻底冷冻(避免将样品先 放入离心管，再将离心管放到液氮中)；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80°C保存；
(3) 无法使用离心管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻， 再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80°C保存；
(4) 采用大体积干冰运输，保证中兴博迈在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
A. 植物组织
大田或野外获取的材料，取材后需用DEPC-H2O将材料表面的灰尘及泥土冲洗 干净，吸干，并将样品分割成100mg左右的小块放入1.5mL或者2.0mL的RNase-free的EP管中，加入RNAlater或类似的RNA组织保存试剂(推荐使用ABI公司的试剂)，并严格按照使用说明进行操作。具有自然屏障防止扩散的植物，如蜡表皮的叶组织 可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater进入组织，液氮速冻后用封口膜封口，再 将EP管放置于50mL离心管中或密封性好的小塑料袋中，用大体积干冰运输，且要 保证中兴博迈在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
B. 动物组织
活体取材后的组织需迅速用RNase-free的0.9%生理盐水漂洗，以去除血渍和污 物，并剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，吸干，并将样品分割成 50mg左右的小块(组织越小，保存效果越好)，放入1.5mL或者2.0mL的RNase-free的 EP管中，并加入RNA later一类的RNA组织保存试剂，液氮速冻后用封口膜封口，再 将EP管放置于50mL离心管中或密封性好的小塑料袋中，用大体积干冰运输，且要 保证中兴博迈在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。样本冷冻参照上述处理方 式；微量样本建议浸入液氮冷冻后在有液氮保护下将组织研磨成粉末并加入足量的 裂解液裂解，参考用量为60mg/mL Trizol，常温裂解5min后，大体积干冰运输。
C. 肿瘤组织
对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请 根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。肿瘤组织本身RNase较活 跃，离体后请立即速冻、分割组织，约2-3mm厚，放入事先装有RNA later(RNA组 织保存试剂)的1.5mL或者2.0mLRNase-free EP管中，液氮再次速冻后用封口膜封口， 用大体积干冰运输，且要保收样组在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
D. 血液淋巴细胞
在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS(1×)，充分混匀；缓慢转入另一已 加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞 分离液液面之上 (即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，3000g离心30min；用移液器小心分离出白细胞层；用PBS(1×)清洗白细胞，离心回收白细胞， 弃去上清；加入白细胞20倍体积的TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块， 整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；放入干冰或于-80°C冰箱中保存。用大体积干冰运 输，且要保收样组在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
条件不允许进行淋巴细胞分离的合作伙伴,请按照以下要求进行血液样 品前处理:提取总 RNA，适用于人和灵长类动物，常温条件下收集全血，向BD 762165 PAXgene Blood RNA Tube（BD静脉真空采 血管(全血RNA管)(2.5mL)分装样品，总送样量全血5mL，全血新鲜采集后，立即盖上 盖子，轻轻颠倒8-10次，大体积干冰运送。
注意事项
1）组织样品，尽量送新鲜采集的样品，液氮速冻，干冰运输。
2）不同类型的样品RNA产量差别较大，需要根据实际情况决定。像人或哺乳动物的 全血中红细胞没有细胞核，每毫升血液中实用细胞数少，RNA得率低，送样量需要 加大；鸟类或鱼类的血液中红细胞含有细胞核，可适当减少送样量；含肌纤维和脂 肪一类物质以及含多糖多酚较高的复杂植物，RNA得率一般较低，送样量需要增加； 代谢活跃的肝脏组织细胞量旺盛，每50mg组织可达20~30ugRNA，可适当降低送样 量。
3）用于RNA样品制备实验的组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时 间过长会导致样品RNA降解。
4）在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进 行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。
六、样品运 输要求
1、样品包装
对于DNA和RNA样品，建议使用1.5mLEP管装载样品，为了防止EP管在运输过 程中受到挤压破裂，导致样品损失，最好将EP管装在50mL离心管或其他支撑物中， 里面还可以添加棉花等固定。(切勿在50mL管内或其他支撑物内加入液氮等危险品)。对于组织样品，一般建议用1.5mL的EP管，或2mL的细胞冻存管装载。在样品运输过程中请用parafilm将管口密封好。不建议样品溶于无水乙醇、异丙醇等有机溶剂中邮寄，因为有机溶剂比较容易泄露，泄露后容易使管壁字迹模糊，甚至造成样品交叉污染。如果一定需溶于有机溶剂运输，那么EP管的管口至少要用 parafilm封5圈以上，并用存放盒装载样品，防止样品管倒置而导致泄漏。
对于血液样品，可用5-10mL抗凝采血管(常用EDTA抗凝管)装载，但为了防止 抗凝管在运输过程中受到碰撞而破裂，需要将抗凝管放在泡沫或棉花中固定，并彼 此隔开。尽量使用塑料材质采血管装载，防止运输过程震荡剧烈或因干冰等低温环 境使采血管破裂。
批量样品(多于15管)请用冻存盒之类的存放盒或泡沫板装载并固定结实，防止 样品散乱在运输箱中受损、丢失，样品的排列应与信息单中的顺序对应。
2、样品标识
不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息，最好将样品名称等各 种信息写在标签纸上，贴在管壁，外面再用透明胶带缠绕一圈(一方面防止样品名称 被泄露的有机溶剂溶掉，另一方面也可以防止标签纸没有粘牢脱落，导致样品无法 识别)，胶带尽量紧贴管壁，避免褶皱影响样品信息的准确。邮寄样品时，必须附有中兴博迈提供的标准格式的样品信息单(电子版、纸质版)， 客户仔细检查，务必保证信息单中填写的样品名称、数量与实际邮寄的样品名称标 识、样品数量完全一致。
3、样品运输条件
DNA样品如果用乙醇沉淀，则可以常温运输，否则在运输过程中，应放于干冰 中，时间最好不要超过72小时；或利用冰袋运输，时间最好不要超过24小时；RNA、 组织样品无论溶于什么溶剂，都需放于干冰中运输，时间最好不要超过72小时；血浆要保存在干冰中运输，确保样品送达接收地点时有足量的干冰剩余，并及时存放血浆于-80°C冰箱中，禁止将样品在室温状态下放置；全血可在冰袋或干冰中 运输，如在冰袋条件下运输，要在12小时内送达；运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的薄厚 有关(为更有利于保温，尽量选用大块的干冰，如果条件允许，建议可在泡沫盒的上 下填充一些棉花等，以隔绝热量的传递)，安全的干冰维持量为5kg/day。中兴博迈接收到样品后，DNA保存于-20°C冰箱，RNA或组织保存于-80°C冰箱，客 户样品如需特殊条件存放，请在信息单中备注说明正确保存温度。抗体、引物、探 针等随样品一起寄送时也需在信息单中注明其对应保存温度。
